石島 歩, 東 隆, 南畑 孝介, 山口 哲志, 山平 真也, 小林 英津子, 飯島 麻里子, 柴崎 芳一, 長棟 輝行, 佐久間 一郎

Ayumu ISHIJIMA, Takashi AZUMA, Kosuke MINAMIHATA, Satoshi YAMAGUCHI, Shinya YAMAHIRA, Etsuko KOBAYASHI, Mariko IIJIMA, Yoshikazu SHIBASAKI, Teruyuki NAGAMUNE, Ichiro SAKUMA

¹東京大学大学院工学系研究科, ²東京大学大学院疾患生命工学センター, ³九州大学応用化学専攻, ⁴東京大学大学院先端科学技術研究センター

¹School of Engineering, The University of Tokyo, ²Center for Disease Biology and Integrative Medicine, The University of Tokyo, ³Department of Applied Chemistry, Kyushu University, ⁴Research Center for Advanced Science and Technology, The University of Tokyo

キーワード :

【目的】
PCND（Phase-change nano-droplet）と抗体を組み合わせたナノメディシンを開発した．PCNDはsub-mmサイズのperfluorocarbonナノ粒子であり，超音波照射によって液滴状態から気泡化する［1,2］．この作用を細胞内で引き起こすことで，がん細胞の物理的破壊を試みた．本稿ではin vitroでの抗体修飾PCNDの特異的標的能評価，細胞内気泡化の高速度撮影，抗がん効果の選択性評価結果について報告する．
【方法】
EREG（Epiregulin）はがん細胞特異的に発現しているリガンドとして知られている［3］．抗EREG抗体である9E5をPCNDに修飾することでEREG高発現細胞への特異標的および細胞内導入が可能となると考えた．EREG高発現細胞としてDLD1，低発現細胞としてAGSを用いた．抗体修飾PCNDのDLD1への特異標的能評価のためにAF647蛍光プローブをPCNDに修飾した．抗体修飾PCNDで標的された細胞を共焦点顕微鏡観察し，フローサイトメーターによって標的能の定量的評価を行った．続いて，100サイクル，最大負圧1.5 MPa，4 MHzの超音波を照射し，高速度撮影（1 Mfps）することで殺傷効果を可視化した．加えて，細胞内気泡化による殺傷効果の定量評価を行った．5サイクル，最大負圧4.6 MPa，5 MHzのパルス波を超音波イメージングプローブで細胞に照射し，PI染色とフローサイトメーターによって細胞の生存率測定を行った．
【結果】
抗体修飾PCNDの細胞内移行が共焦点顕微鏡観察によって明らかになった．細胞膜は緑色で染色し，細胞内にPCND由来蛍光が確認された．フローサイトメトリー解析結果においても97.8±0.5％のDLD1に対して抗体修飾PCNDが選択的に標的されていた．細胞内気泡化を高速度観察した結果，超音波照射すると気泡化初期段階において細胞膜が破壊され，大きな形態変化を引き起こした（Fig. 1）．フローサイトメトリー解析においても高い選択性でDLD1生存率を43.0±5.6％まで減少させた（AGS生存率= 98.0±0.2％）．
【結論】
これまでPCNDによるがん細胞選択的な抗がん効果を得るために抗がん剤が併用されていた［4］．我々は世界で初めて抗がん剤を併用せずにPCNDによる細胞選択的殺傷を実現した．
【参考文献】
1. Kawabata K et al. Jpn J Appl Phys 2005; 44: 4548.
2. Ishijima A et al. Ultrasonics 2016; 69: 97-105.
3. Lee YH et al. Biochem Biophys Res Commun 2013; 441: 1011-1017.
4. Wang CH et al. Biomaterials 2012; 33: 1939-1947.