高田 亮¹, 小田 雄介², 鈴木 亮², 工藤 信樹¹

Ryo TAKADA¹, Yusuke ODA², Ryo SUZUKI², Nobuki KUDO¹

¹北海道大学大学院情報科学研究科生命人間情報科学専攻, ²帝京大学薬学部薬物送達学研究室

¹Division of Bioengineering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology, Hokkaido University, ²Laboratory of Drug and Gene Delivery System, Faculty of Pharma-Sciences, Teikyo University

キーワード :

【目的】
樹状細胞を用いたがん免疫療法において，ソノポレーションの応用が期待されている．樹状細胞の抗原提示機能を利用してがん細胞を効率的に攻撃するためには，抗原を樹状細胞の細胞質へ直接送達する必要がある．我々はこれまで，抗原を模擬した蛍光試薬NBDを付加した微小気泡を細胞に取り込ませてソノポレーションを行うことで，抗原の導入が可能であることを報告してきた．本研究では，細胞内に貪食された気泡と細胞外に接着した気泡による導入の比較観察を行い，抗原導入が促進される機序を検討した．
【方法】
観察には倒立型共焦点顕微鏡を用いた．顕微鏡のステージ上には，観察チャンバを設けた水槽を設置した．観察チャンバは，水槽の底面に穴を開け，下面に細胞を培養したカバーガラスを，上面に通常のカバーガラスを貼り付けることで作成した．細胞はマウス骨髄由来樹状細胞株（DC2.4）を使用した．DC2.4の細胞膜をCellMask Deep Redで染色した後，気泡シェルをNBDでラベルしたバブルリポソーム（BL）懸濁液に浸し，静置することで気泡を接着，あるいは貪食させた．超音波振動子は，直径50 mm，焦点距離70 mm，中心周波数1 MHzの集束型振動子を用い，3周期の正弦波パルスで駆動した．自由水中における最大負圧は0.55 MPaである．
【結果および検討】
細胞の外部と内部に気泡を有する細胞の観察例をFig. 1に示す．超音波照射前後の蛍光像を気泡（緑）と細胞膜（赤）の蛍光像の重ね合わせで示してある．超音波照射前後の画像の比較から，細胞外気泡では細胞膜に気泡シェルが刺さった様子（青矢頭）が，細胞内気泡では気泡シェルがファゴソームから脱出し，細胞質へ導入された様子（黄矢頭）が観察された．それぞれの気泡位置について複数回実験を行い，導入率を求めた結果をFig. 2に示す．細胞内気泡を用いたソノポレーションでは，細胞外気泡の場合と比べて明らかに高い導入率が得られた．細胞外気泡においてシェル導入率が極端に低かった原因として，漏出した細胞質が気泡のシェルを押し流してしまったこと，気泡と細胞間ではなく気泡とカバーガラス間に相互作用が生じたことが挙げられる．
【結論】
結果より，細胞に貪食された気泡に対する超音波照射が導入効率向上に有用であることが確認され，樹状細胞への抗原導入誘導機序の一部を明らかにしたと言える．