東 隆, 張 一偉, 尾崎 太一, 井上 和仁, 高木 周, 松本 洋一郎

Takashi AZUMA, Yiwei ZHANG, Taichi OSAKI, Kazuhito INOUE, Shu TAKAGI, Yoichiro MATSUMOTO

東京大学工学部

Faculty of Engineering, The University of Tokyo

キーワード :

超音波遺伝子導入は，超音波照射によりマイクロバブルの振動を励起し，マイクロバブル周辺の細胞に対して局所的な膜透過性の向上をはかるソノポレーションにより細胞内への遺伝子導入を実現する方法である．これまでマウス等の動物実験によりその効果が確認されている．また，単一マイクロバブルの振動と圧壊の顕微鏡下高速度観察によるメカニズム解明の試みなどがなされてきた．前者のマクロな導入効果の検討と，後者のミクロな現象の観察の間には，多くのバブルと細胞が混在した現象が未だ十分には解明されていない領域があった．本研究では，細胞培養容器内での遺伝子導入における光学及び音響的な計測を通したソノポレーションメカニズムの検討と，マイクロバブルを音響的にマニュピレーションするツールの開発に関する報告を行う．
細胞培養容器にソナゾイドを封入した状態で上面に超音波トランスデューサを固定し，HeNeレーザーによる培養容器内の光透過率の計測と，フォーカスハイドロフォンによる培養容器内で発生する音響信号の計測を行う系を構築し，バブル濃度の時間変化の計測とキャビテーションに関連する非線形信号の取得を行った．この結果と，同条件におけるNIH3T3細胞に対する色素FITC-Dextranの導入効率及び細胞生存率の計測結果の比較を行った．0.1〜1.2 MPaの音圧，10〜60秒の照射時間，バースト長20μs，バースト波繰り返し周期5 kHzの条件にて超音波照射を行った．この結果，色素の導入が行われる音圧0.4 MPa以上の条件では，照射開始から10秒程度でマイクロバブルの濃度は大きく低下する一方で，分調波などの非線形音響信号は60秒間の照射の間継続的に観察された．この結果はシェル付のマイクロバブルが圧壊したあとも，圧壊に伴い生成したマイクロバブルが存在し続けている可能性を示している．色素の導入効率は照射開始から20秒までは大きく向上しているが，それ以降は導入効率の上昇は見られず，一方で細胞生存率は，60秒間の照射中一定して低下し続けていた．この結果から，ソナゾイドの振動は色素の導入効率の向上と，細胞の生存率低下の両方に寄与していると考えられる．しかし，ソナゾイド圧壊後に生成したマイクロバブルの振動は，色素の導入効率の向上には寄与が小さく，細胞の生存率低下のみに大きく寄与していると考えられる．
これまでソノポレーションの研究においては，導入率と細胞生存率の間のトレードオフが課題であった．今回の結果は，シェルつきのマイクロバブルの個数が有限のため，シェルつきのマイクロバブルが壊れる前と，壊れた後で，導入率と生存率への寄与が異なることを示しており，継続的なソナゾイドの導入により導入効率の向上がはかれる可能性を示している．また，マイクロバブルが存在する平面と同一平面上に，対象領域を取り囲むように配置した円環状のトランスデューサから照射する超音波の位相分布の制御によりマイクロバブルの位置をマニュピレーションする技術，及びマイクロバブルが存在する平面に対して超音波伝搬方向が直交するように配置した集束超音波トランスデューサを用いてマイクロバブルの位置をマニュピレーションする技術を構築したので，そのバブルマニュピレーションの制御精度の評価結果に関する報告を行う．