Online Journal
電子ジャーナル
IF値: 1.878(2021年)→1.8(2022年)

英文誌(2004-)

Journal of Medical Ultrasonics

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2010 - Vol.37

Vol.37 No.Supplement

一般口演
基礎:生体作用

(S322)

超音波によるsonochemical preconditioningによって細胞にもたらされるストレス耐性

Stress tolerance of the cell induced by a sonochemical preconditioning using ultrasound

久米 真1, 佐藤 香奈2, 大川 浩一3, 工藤 和大1, 阿部 ゆき1, 伊藤 英晃4, 菅原 勝康5, 山本 雄造1

Makoto KUME1, Kana SATOH2, Hirokazu OKAWA3, Kazuhiro KUDO1, Yuki ABE1, Hideaki ITOH4, Katsuyasu SUGAWARA5, Yuzo YAMAMOTO1

1秋田大学大学院医学系研究科・消化器外科, 2秋田大学大学院工学資源学研究科・環境物質工学専攻, 3秋田大学工学資源学部・地球資源学科, 4秋田大学工学資源学部・生命化学科, 5秋田大学工学資源学部・環境応用化学科

1Department of Gastroenterological Surgery, Akita University Graduate School of Medicine, 2Department of Materials-process Engineering and Applied Chemistry for Environments, Graduate School of Engineering and Resource Science, Akita University, 3Department of Earth Science and Technology, Faculty of Engineering and Resource Science, Akita University, 4Laboratory of Molecular Biology, Faculty of Engineering and Resource Science, Akita University, 5Energy Chemical Engineering Laboratory, Faculty of Engineering and Resource Science, Akita University

キーワード :

【背景】
肝胆膵外科領域の技術革新は治療効果のめざましい成果とひき替えに臓器保存,血行再建,感染・炎症,代謝負荷など生体への高侵襲に由来する様々な臓器障害のリスクをもたらす結果となった.拡大手術の対極にある潮流は内視鏡外科に代表される低侵襲手術である.しかし,我々は侵襲を小さくする技術とは別次元で侵襲に対する生体側の耐性を高める技術開発が重要であると考え,stress preconditioningの研究に取り組んできた.これはあらかじめ虚血や熱ショック,細胞毒(薬剤)などに暴露することで細胞にストレス応答を惹起してその後の侵襲に対する耐性を人為的に誘導する技術である.しかし,虚血,熱,薬剤などの方法は苦痛や毒性を適切にコントロールし難い為にヒトへの臨床応用が困難であった.安全で苦痛が少なく合理的かつ有効に標的細胞にストレス応答を誘導しストレス耐性を獲得させる新技術が求められる.
【目的】
超音波によって細胞のストレス応答を誘導し酸化ストレスに対する耐性を獲得させるsonochemical preconditioningの効果を検討した.
【方法】
37°C,5%CO2インキュベータ内でFBS含有DMEM培地に培養したHuH7細胞を用いた.超音波照射装置は周波数1MHz,出力0.5〜2.3W可変・定常波(本多電子,豊橋市)に自作の温度コントローラーを併設し,振動子と培養シャーレ底面とをgelを介して密着させて実験した.①無細胞シャーレに純水2mlを満たし,超音波照射(0.5W,1.4W,2.3W)の経過中シャーレ内純水中に発生するH2O2濃度を経時的にKI法で定量した (μM).②HuH7細胞に出力1.4W,2.3Wの超音波を20分間照射し6時間後Western blottingでheat shock protein 72(HSP72),hemeoxygenase-1(HO-1)発現を検討した.また免疫染色でNrf-2 の核移行を検討した.③出力2.3W20分間超音波照射後6時間培養した細胞と無前処置細胞の培地にH2O2を添加しH2O2濃度250μMで 0,3,5,10時間培養後のCell viabilityをtrypan blue exclusion testで定量した.n=6,mean±SD.Student t-test.
【結果】
①出力1.4Wと2.3Wの超音波を照射したときシャーレ内純水中にH2O2の生成を確認した.出力1.4Wに比して2.3W照射でH2O2生成量は高く,照射時間経過と共にH2O2濃度は漸増し20分照射時点で1.4W; 4.0μM,2.3W; 17.0μMに達した.②HuH7細胞は定常状態でHSP72の発現を認めないが若干のHO-1を認める.出力1.4W照射後はHSP72,HO-1共に誘導されなかった.出力2.3Wを20分間照射するとHO-1が誘導され,6時間後の細胞内HO-1タンパク量が増加した.また,2.3W照射1,2,3時間後の細胞核に免疫染色でNrf-2が濃染され,Nrf-2の核移行が確認された(2時間後が最強).培養液温度を管理しないと超音波照射に伴って発熱し細胞にHSP72発現を認めたが,厳密に温度管理すると出力2.3WでHO-1の誘導は明らかであったがHSP72は誘導されなかった.③無前処置HuH7細胞に250μM H2O2を添加すると急速に細胞は死滅する(% viability; 0h, 93.5±3.1%, 3h, 76.4±2.3%, 5h, 35.2±10.1%, 10h, 16.2±6.3%).温度管理下に出力2.3W超音波20分間照射後6時間経過した細胞にH2O2を添加すると細胞のviabilityは無処置細胞よりも維持された(0h, 85.5±5.2%, 3h, 81.6±5.5%, 5h, 64.5±6.2%*, 10h, 21.4±7.4%) (*; p<0.01 vs. 無前処置細胞).
【結論】
超音波を用いて細胞環境に活性酸素種を生成し,細胞のストレス応答を誘導することが可能であった.この超音波前処置sonochemical preconditioningによって人為的にHO-1を発現させた細胞にストレス耐性を誘導し得ることが明らかとなった.