白幡 陽, 工藤 信樹

You SHIRAHATA, Nobuki KUDO

北海道大学大学院情報科学研究科生命人間情報科学専攻

Division of Bioengineeering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology Hokkaido University

キーワード :

【はじめに】
我々は遺伝子や薬剤を細胞内に導入することを目的に，パルス超音波と微小気泡を用いる音響穿孔法（ソノポレーション）に関する検討を行っている．これまでは基礎的検討として基板上に接着した細胞を対象に検討を行ってきたが，生体内細胞への応用を考慮した場合には，細胞の伸展状態が生体内の細胞と大きく異なることが最適導入条件の決定に影響を与えることが懸念される．そこで我々は，微小な培養ウェルの大きさや，その中に入れる細胞の数を変えることでこれまで制御できなかった細胞の伸展を制御することを考えた．本報告ではこれを目的に製作した微小培養ウェルを作製し，ソノポレーションを試行した結果を述べる．
【方法】
厚膜フォトレジストSU-8 3050（日本化薬）を用いてフォトリソグラフィにより18 mm角のカバーガラス上に培養ウェルを作製した．直径20〜200 m（10 mステップ）の円形ウェルを18列配置するパターンとした．微小培養ウェルを作製したカバーガラスを35 mmシャーレ内に置き，2×105個の細胞を懸濁した培養液を2 mL入れ，3日間，37℃，5％CO2湿度100％下で培養した．細胞としてはヒト前立腺がん細胞（PC-3）を，培養液は10％のウシ胎児血清を加えたRPMI1640培養液を用いた．倒立型顕微鏡のステージ上に置いた水槽の底面に穴を開け，上面に細胞試料の培養面を下向きに，下面には通常のカバーガラスを張り付けることで観察チャンバを構成した．チャンバ溶液には細胞膜の損傷を検出する蛍光色素としてPI（propidium iodide）とLevovistをそれぞれ5 g/ml, 5 mg/mlの濃度で添加したハンクス緩衝液を用いた．微小気泡が浮力により細胞に付着するのを待って中心周波数1 MHz，最大負圧1.3 MPa，波数3波のパルス超音波を1回照射した．
【結果および検討】
同径のウェルに異なる数の細胞が培養されている様子をFig. 1に示す．（a）よりも細胞数の多い（b）の方が細胞の伸展の度合い小さいことが確認でき，微小ウェルが細胞の伸展制御に有用であることが確認された．ウェル内に培養された細胞にPIが導入される様子も観察できた．今後，ソノポレーションによる細胞膜の損傷・修復と細胞の伸展状態の関連について定量的検討を行っていく．
【謝辞】
本研究の遂行に際し，ご助言・ご討論をいただいた細胞情報工学研究室繁富香織研究員に感謝する．また本研究の一部は，科研費補助金（23300182，25560233）により行われた．